Purificação protéica mais eficiente

A utilização dos OGMs para a produção de biofármacos tem possibilitado a síntese de alguns tipos de proteínas recombinantes. Para tanto, existem diversas tecnologias à disposição, tais como, o sistema de produção a partir de bactérias, o uso de leveduras e fungos filamentosos, de culturas de células de mamíferos, de mamíferos transgênicos, de ovos de galinha e de insetos e plantas.

Independente da tecnologia utilizada, muitos entraves, como por exemplo, a purificação de proteínas, ainda são encontrados para a produção dos biofármacos, exigindo um número cada vez maior de pesquisas que buscam solucioná-los. Foi com esse intuito que cientistas de diversas instituições de pesquisa, incluindo o National Institute of Standards and Technology (NIST), EUA, desenvolveram um estudo com medicamentos à base de proteínas geneticamente modificadas para descobrir como produzi-las em larga escala e com alto grau de pureza.

A proteína usada na pesquisa foi uma variante da subtilisina, uma protease (enzima que digere proteínas) que pode ser obtida a partir de bactérias presentes no solo, como por exemplo, o Bacillus amyloliquefaciens, utilizada nessa pesquisa.

O estudo teve como objetivo principal desenvolver um método que possibilitasse a captura e purificação da sublisina, que ao ser alterada geneticamente, pode ser ativada no momento correto, quando presente em um medicamento. A maior dificuldade foi encontrar um mecanismo eficiente que conseguisse separar essa proteína de tantas outras produzidas pelo microorganismo.   

Esse processo foi desenvolvido em diferentes etapas, iniciado pela criação de várias cópias da enzima que, devido à modificação sofrida, se tornam ativas apenas na presença dos ânios flúor e azida. Após essa primeira etapa, as cópias foram colocadas em um substrato, que ao sofrer uma transformação, ficou mais seletivo. Posteriormente, o processo foi direcionado de forma a quebrar qualquer ligação entre a sublisina e outras proteínas, para o isolamento de seu sítio ativo. A finalização se deu pela ligação da protease com os ânions específicos.


De acordo com os resultados obtidos no estudo, foi detectada uma alta atividade da enzima quando ligada ao ânion azida.  Em contrapartida, os pesquisadores encontraram uma forma inativa da proteína complexada com o ânion e com um substrato que envolveu o sítio ativo da enzima. Como meio de comparação, os cientistas utilizaram três estruturas cristalinas do substrato complexado – ânion livre, flúor e azida saturados – para compreender o seu mecanismo de catálise e de ligação.

Por meio desses mecanismos, os pesquisadores conseguiram imobilizar a sublisina e iniciar o processo de purificação de proteínas. As moléculas protéicas foram ligadas a uma coluna e lavadas de forma a livrá-las de contaminantes e a ruptura das ligações foi feita pela adição de flúor, liberando a proteína de interesse.

Os testes realizados com essas estruturas forneceram novos dados sobre o mecanismo de ligação e de catálise do substrato contendo a sublisina. A partir dessas informações será possível desenvolver várias ferramentas biotecnológicas baseadas na proteólise ativada por ânions. O conhecimento adquirido sobre o processo de ligação entre a proteína e os ânions possibilitará a obtenção de proteínas com um grau cada vez maior de pureza. É importante avaliar também qual o destino da proteína que se pretende purificar, podendo servir para estudos acadêmicos, para o uso industrial ou terapêutico, pois para cada caso o grau de purificação varia muito, o que irá refletir diretamente no custo do processo.

06/11/2009
Arlei Maturano - Equipe Biotec AHG